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Thématique de recherche MEM

Bactéries et métaux

Publié le 21 mars 2019

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Pascal ARNOUX, Mila KOJADINOVIC, Monique SABATY & David PIGNOL​​

Technicien/Ingénieur: Sandrine GROSSE & Catherine BRUTESCO

Doctorant​: Pierre-Xavier Maziani

Postdoctorant: Lionel Tarrago

Cet axe de recherche est dédié à l'étude des mécanismes d'acquisition des métax et de maturation des métalloprotéines. Des approches de génétique microbienne couplées à des approches de biochimie structurale permettent d’obtenir des informations structurales sur des familles d’enzymes peu caractérisées et sur des mécanismes enzymatiques originaux de synthèse de chélateurs (métallophores). Ces approches contribuent ainsi potentiellement à la découverte de mécanismes catalytiques originaux ainsi qu’à de nouvelles molécules aux propriétés inconnues. Cet axe fondamental permet de nourrir l’axe biotechnologie du laboratoire, notamment via des développements en bioremédiation et biodétection.
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Molybdo-réductases

Des systèmes enzymatiques de Rb sphaeroides ou d'E. coli sont caractérisés : (i) la nitrate réductase périplasmique (NapAB) qui est capable de réduire les oxydes de sélénium et (ii) l’oxydo-réductase MsrP, jouant un rôle dans la réparation du stress oxydant induit par le stress métallique (iii) la formiate déshydrogénase impliquée dans la réduction du CO2 (17). Nos travaux visent depuis plusieurs années à caractériser ces métalloprotéines au niveau structural (1, 17), biochimique (2,3,15) et biophysique (4, 5, 6, 7, 8, 9, 14) et se poursuivent actuellement dans le cadre d’un projet ANR blanc (MC2, 2011-2015) dont l’objectif est de comprendre la spécificité de substrat de ces métalloprotéines.

Synthèse de chélateurs de métaux

Nos travaux sont centrés sur deux familles de chélateurs : la nicotianamine et la phytochélatine.

La nicotianamine (NA) est une petite molécule présente chez toutes les plantes qui possède la capacité de se lier à différents métaux tels que le Cu2+, le Zn2+, le Mn2+ et le Ni2+. La nicotianamine synthase (NAS) catalyse la biosynthèse de NA par condensation de trois molécules de S-adenosylméthionine. Nous avons étudié une protéine apparentée aux NAS eucaryotes mais provenant de l’archaea Methanothermobacter thermautotrophicus. Par une approche structurale, nous avons pu décrire pour la première fois un mécanisme enzymatique original de la synthèse de la NA (10,11,12). Nos travaux se poursuivent actuellement par l’étude d’analogues de NAS issus du monde bactérien.

La staphylopine: La caractérisation structurale de la famille nicotianamine synthase (NAS), couplée à une analyse génomique nous a permis de proposer l'existence d'enzymes NAS-Like dans le domaine des bactéries. L'étude de ce système à travers l'exploration métabolomique, la mutagénèse ciblée, et l'analyse biochimique, nous a permis de découvrir un opéron chez Staphylococcus aureus qui code les différentes fonctions (systèmes d'export et d'import) requises pour la  biosynthèse et le trafficking d'un metallophore à large spectre, analogue à la nicotianamine et baptisé la staphylopine. La biosynthèse de la staphylopine nécessite l'association de trois activités enzymatiques, jamais caractérisées à ce jour. Nous avons en outre démontré que la staphylopine est impliquée dans l'acquisition du nickel, cobalt, zinc, cuivre et  du fer, selon les conditions de croissance. Cette voie de biosynthèse étant conservée chez plusieurs pathogènes, nos travaux soulignent l'importance de cette stratégie d'acquisition de métaux dans une infection bactérienne. Cette découverte a été récemment accepté pour publication dans la revue Science (18) et ouvre la voie à de nombreuses applications biomédicales potentielles.




















Structure du complexe NapAB de Rhodobacter sphaeroides
Crédit : Pascal Arnoux/CEA
 

Structure de la nicotianamine synthase
de Methanothermobacter thermautotrophicus
Crédit : Pascal Arnoux/CEA
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Modèle de fonctionnement de la staphylopine impliquant trois enzymes de biosynthèse (en bleu, noir et fushia), un exporteur (magenta), et un importeur de la famille des ABC transporteurs (simplifié en orange).
Crédit : Pascal Arnoux/CEA​
Collaborateurs
  • A. Magalon and F. Barras (LCB Marseille)
  • R. Voulhoux (LISM, Marseille)
  • E. Borezée-Durant (INRA, Jouy en Josas)
  • R.​ Lobinski & L. Ouerdane (Université de Pau et du Pays de l'Adour)
  • M. Carrière (CEA Grenoble)
Financements
  • ANR MC2 (2011-2015), coordinator C. Leger (BIP Marseille)
  • Programme Toxnuc ( BAMACO), coordinator D. Pig​nol
  • ANR ANIBAL (2015-2018), coordinator P. Arnoux.
  • ANR METOXIC (2016-2019), coordinator B. Ezrati (LCB, Marseille)
  • VLM (2016-2019), coordinator R Voulhoux (LISM, Marseille).
Publications​

 

  1. Arnoux P, Sabaty M, Alric J, Frangioni B, Guigliarelli B, Adriano JM, Pignol D (2003) Structural and redox plasticity in the heterodimeric periplasmic nitrate reductase.Nature Struct. Biol. 10(11):928-934. 
  2. Dementin S, Arnoux P, Frangioni B, Grosse S, Léger C, Guigliareli B, Burlat B, Sabaty M, Pignol D (2007)Insights into the substrate binding site of the periplasmic nitrate reductase from site direct mutagenesis.Biochemistry 46(34):9713-9721.
  3. Pierru B, Grosse S, Pignol D, Sabaty M (2006) Genetic and biochemical evidences for the 1 involvement of a molybdo-enzyme in one of the selenite reduction pathways of Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificans IL106.Appl Env. Microb.72(5):3147-3153.
  4. Bertrand P, Frangioni B, Dementin S, Guigliarelli B, Sabaty M, Arnoux P, Pignol D, Léger C (2007) Effects of slow substrate binding & release in redox enzymes: theory and application to periplasmic nitrate reductase.J. Phys. Chem. 111(34):10300-1031.
  5.  Fourmond V, Sabaty M, Arnoux P, Bertrand P, Pignol D, Léger C (2010) Reassessing the strategies for trapping catalytic intermediates during nitrate réductase turn-over. J Phys Chem B 114(9):3341-3347.
  6. Fourmond V, Burlat B, Dementin S, Sabaty M, Arnoux P, Etienne E, Guigliarelli B, Bertrand P, Pignol D, Leger C (2010) Dependence of catalytic activity on driving force in solution assays and protein film voltammetry. Biochemistry-US 49(11):2424-
  7. Fourmond V, Lautier T, Baffert C, Leroux F, Dementin S, Liebogg P, Rousset M, Arnoux P, Pignol D, Meynial Salles I, Soucaille P, Bertrand P, Léger C (2009) Correcting for electrocatalyst dersorbtion or inactivation in chronoamperometry experiments.Anal Chem, 15;81(8):2962-2968 doi: 10.1021/ac8025702.
  8.  Fourmond V, Burlat B, Dementin S, Arnoux P, Sabaty M, Boiry S, Guigliarelli B, Bertrand P, Pignol D, Léger C. (2008) J Phys Chem B.Major Mo(V) EPR signature of Rhodobacter sphaeroides periplasmic nitrate reductase arising from a dead-end species that activates upon reduction. Relation to other molybdoenzymes from the DMSO reductase family. 112(48):15478-15486. doi: 10.1021/jp807092y.
  9. Frangioni B, Arnoux P, Pignol D, Sabaty M, Bertrand P, Guigliarelli B (2004) In Rhodobacter sphaeroides respiratory nitrate reductase, the kinetics of substrate binding disrupts the energetics of the catalytic cycle and favors intramolecular electron transfer. J. Am. Chem. Soc. Feb 11;126(5):1328-1329. 
  10. Dreyfus C, Pignol D, Arnoux P (2008) Expression, purification, cristallization and preliminary X-ray analysis of an archael protein homologous to plant nicotianamine synthase. Acta Cryst. F64, 933-935 
  11.  Dreyfus C, Lemaire D, Mari S, Pignol D, Arnoux P (2009) Crystallographic snapshots of substrate translocation during phytosiderophore synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 106(38):16180-16184. 
  12.  Dreyfus C, Larrouy M, Cavelier F, Martinez J, Pignol D, Arnoux P (2011) Crystallographic structure of thermoNicotianamine synthase with a synthetic reaction intermediate highlights the sequential processing mechanism. Chem Commun (Camb). 28;47(20):5825.
  13.  Vivares D, Arnoux P, Pignol D (2005) A papain-like enzyme at work : crystal structure of native and acyl-enzyme intermediates in phytochelatin synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102(52):18848–18853.
  14. Jacques J, Fourmond V,Arnoux P,Sabaty M, Emilien E, Grosse S, Biaso F, Bertrand P, Pignol D, Léger C, Guigliarelli B, Burlat B (2014) Reductive activation in periplasmic nitrate reductase involves chemical modifications of the Mo-cofactor beyond the first coordination sphere of the Mo ion.Biochim Biophys Acta.doi: 10.1016/j.bbabio.2013.10.013.
  15. Sabaty M, Grosse S, Adryanczyk G, Boiry S, Biaso F, Arnoux P, Pignol D (2013) Detrimental effect of the 6 His C-terminal tag on YedY enzymatic activity and influence of the TAT signal sequence on YedY synthesis.BMC Biochem. 2013 Nov 1;14(1):28
  16. Jacques J, Burlat B, Arnoux P, Sabaty M, Guigliarelli B, Léger C, Pignol D, Fourmond V. (2014) Kinetics of substrate inhibition of periplasmic nitrate reductase. BBA – Bioenergetics doi: 10.1016/j.bbabio.2014.05.357
  17.  Arnoux P., Ruppelt C., Oudouhou F., Lavergne J., Siponen M.I., Toci R.,  Bittner F., Mendel R.R., Pignol D., Magalon A. & Walburger A. (2015) "Sulfur shuttling across a chaperone during molybdenum cofactor maturation"  Nature Communication  2015 Feb 4;6:6148. doi: 10.1038/ncomms7148.

  18. Ghssein G, Brutesco C, Ouerdane L, Fojcik C, Izaute A, Hajjar C, Lobinski R, Lemaire D, Richaud P, Voulhoux R, Espaillat A, Cava F, Pignol D, Borezee-Durant E & Arnoux P (2016) Biosynthesis of a broad-spectrum nicotianamine-like metallophore in Staphylococcus aureus. Science    May 27;352(6289):1105-9. doi: 10.1126/science.aaf1018.​     ​


 

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