Crible métabolique : principe, réalisation et validation

Dans une première étape, un crible métabolique est élaboré et construit. Le principe d'un crible métabolique consiste à faire dépendre la croissance des bactéries du produit de la réaction catalysée par l'enzyme qu'on désire améliorer ou par la voie métabolique soumise à évolution. En absence de limitation de substrat, la disponibilité du produit de la réaction pour les cellules-hôtes dépendra de l'efficacité de la conversion catalysée. La robustesse de la sélection génétique, c'est-à-dire sa stabilité dans le temps et sous diverses conditions de culture et la stricte dépendance envers le ou les gènes mis sous sélection est un prérequis fondamental.

Le microorganisme hôte habituellement utilisé est Escherichia coli. Les modifications génétiques nécessaires pour la construction du crible métabolique sont introduites par les techniques classiques de génétique moléculaire.

Evolution et sélection in vivo de variants améliorés

De nombreuses méthodes de sélection in vitro d'enzymes améliorés sont aujourd'hui disponibles, utilisant en général des protocoles de mutagénèse aléatoire des gènes et le criblage fonctionnel à haut débit.

La sélection in vivo est une alternative à ces méthodes souvent coûteuses en termes d'appareillage et de main d'œuvre. Elle repose sur la génération spontanée des mutations dans le génome de populations bactériennes importantes (>10⁹) cultivées en suspension. La sélection des variants recherchés parmi les mutants du pool s'opère en imposant des conditions de cultures contraignantes, vis-à-vis desquelles les mutations d'intérêt confèrent aux bactéries mutantes un taux de croissance plus élevé.  Afin de sélectionner ainsi une lignée de cellules portant des mutations adaptatives dans leur génome, la culture cellulaire en suspension doit être maintenue pendant des périodes de temps prolongées. Le Genoscope met en œuvre un dispositif de culture continue de microorganismes, le GM3. Le GM3 automatise les étapes de cultures prolongées – dilution de la suspension cellulaire pour la création d'une pression sélective, nettoyage périodique de la chambre d'incubation – et permet la programmation de différents régimes sélectifs.