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Laboratoire | Chimie


LSOD

Stress oxydant et détoxication

Publié le 6 avril 2017

Responsable
Pierre Dorlet
pierre.dorlet@cea.fr

Techiniques biochimiques, enzymologiques, biophysiques et bioinformatiques

Le LSoD regroupe des chercheurs qui, pour caractériser les mécanismes moléculaires de fonctionnement de protéines associées aux stress (hémoprotéines, métalloprotéines et flavoprotéines) ou à la détoxication (cytochromes P450, glutathione-S-transférases, P-glycoprotéine), utilisent des techniques biochimiques, enzymologiques, biophysiques et bioinformatiques.

  • La biologie moléculaire pour la production de protéines natives et mutantes (systèmes d’expression hétérologue : Escherichia coli, Lactococcus lactis).
  • Les méthodes biochimiques de production, d’identification et de caractérisation de protéines et/ou de domaines protéiques, de substrats et de métabolites.
  • Apport de la chimie : modèles synthétiques et biomimétiques (complexes de fer hémique et non hémique, complexes de cuivre et de manganèse).
  • Les spectroscopies Raman, Raman de résonance et FTIR qui permettent de caractériser la structure et l’environnement des chromophores (hèmes, flavines, …) des espèces étudiées.
  • Les spectroscopies de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE, ENDOR, ESEEM, HYSCORE) qui permettent la caractérisation structurale et électronique des espèces paramagnétiques (radicaux, CuII, FeIII, …)
  • Les méthodes d'analyse de cinétiques réactionnelles rapides (stopped-flow, freeze-quench) et de productions catalytiques (fluorimétrie, HPLC…).
  • Les méthodes de modélisation moléculaire.

 

Processus de détoxication et de stress oxydant.

Le stress oxydant  est un phénomène essentiel au déclenchement et au développement de nombreuses maladies incluant les cancers, les maladies inflammatoires et cardiovasculaires, ainsi que les maladies neurodégénératives. Cependant les mécanismes de détoxication ou de production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (RNOS, voir Figure) ainsi que leur réactivité biologique ne sont pas encore caractérisés de façon claire et complète. Ceci est illustré dans le cas des maladies neurodégénératives pour lesquelles la présence et l’activité d’enzymes de détoxication n’ont été décrites que récemment et très partiellement. D’autre part, les RNOS semblent jouer des rôles différents sinon opposés, tels que signalisation, neuroprotection ou cytotoxicité. Notre équipe s’attache à décrypter les processus catalytiques de détoxication  ou de production des RNOS, avec une attention particulière à plusieurs systèmes fortement impliqués dans ces pathologies :

  • les métallo-peptides tels que Cu-amyloïde impliqué dans la maladie d’Alzheimer. Un des aspects clés de leur toxicité est lié à la production de ROS
  • les NO-synthases (NOS) sont maintenant considérées comme jouant un rôle déterminant dans plusieurs pathologies neurodégénératives ou cardiovasculaires via la production de RNOS
  • le développement de nouveaux agents actifs envers des lignées cellulaires représentatives de médulloblastome et leurs mécanismes d’action envers les cytochromes P450 et la production de RNOS

Métabolisme des xénobiotiques

Pour lutter contre les agressions par les xénobiotiques, l’organisme humain s'est doté de trois systèmes enzymatiques spécialisés et complémentaires permettant l’élimination des composés étrangers et qui participent à la détoxication cellulaire (voir figure). Ces enzymes sont : les cytochromes P450 (CYPs) dans la phase de fonctionnalisation (Phase I du métabolisme des xénobiotiques), les enzymes de conjugaison ou transférases (Phase II) telles que les glucuro- ou glutathion-S-transférases (dont la mGST membranaire), et les protéines de transport et d’efflux telles que la P-glycoprotéine (P-gp) (Phase III). Elles sont localisées dans des membranes différentes (réticulum endoplasmique ou membrane plasmique) et peuvent agir en synergie pour une plus grande efficacité de détoxication du foie, principal organe exposé aux xénobiotiques par la voie orale. Le CYP3A4 et la P-gp se caractérisent par une reconnaissance moléculaire multispécifique vis-à-vis d’une grande diversité de structures chimiques et partagent de nombreux substrats en commun. Du fait de leur hydrophobicité, ces substrats communs sont reconnus par ces enzymes au sein même de la membrane.

 

Nous nous intéressons à mieux comprendre la synergie fonctionnelle de prise en charge par la mGST ou la P-gp des métabolites produits par les P450s et en particulier le CYP3A4, ainsi qu’à déterminer les mécanismes moléculaires de reconnaissance multispécifique de ces trois protéines membranaires. Ces enzymes seraient ainsi capables de fonctionner "en parallèle" pour protéger la cellule contre des toxiques hydrophobes mais aussi "en série", c'est-à-dire qu'un produit issu de l'activité enzymatique du CYP3A4 pourrait être efflué hors de la cellule par la P-gp ou via la mGST.
Les molécules étudiées sont en particulier des médicaments en cours de développement ainsi que des composés rencontrés dans notre environnement et pouvant conduire à des problèmes de santé publique.

Etude structure-fonction des enzymes du stress oxydant

A l’échelle moléculaire, nous étudions les relations structure-fonction d’un certain nombre de protéines jouant un rôle important dans le stress oxydant et la détoxication cellulaire. Afin de mieux cerner les mécanismes catalytiques et les transferts intramoléculaires d’électrons, et éventuellement de protons, à l’origine des  propriétés fonctionnelles de ces protéines, nous visons notamment  à déterminer la structure et l’environnement de sites actifs héminiques (NO synthases (NOS), protéines « NOS-like », cytochromes P450, transporteurs d’oxygène, complexe amyloïde-β-hème), non héminiques (complexes peptides-métaux, superoxyde réductases) et flaviniques (flavoprotéines de la famille des oxydo-réductases à pyridine nucléotide et disulfure, domaine réductase des NOS).
Une large gamme de méthodologies est mise en œuvre. Elle inclut l’enzymologie, la biologie moléculaire, des mesures de cinétiques rapides, la chimie biomimétique, les spectroscopies vibrationnelles (IR et Raman), d’absorption électronique  et de résonance paramagnétique électronique (RPE classique, à impulsions et ENDOR), et la bioinformatique (dynamique moléculaire, docking). 

Projection I2BC : La thématique Stress oxydant et détoxication devient l'équipe Stress oxydant et détoxication dans le département B3S (Biochimie, Biophysique et Biologie Structurale) de l'I2BC.

Mots clés

Stress Oxydant. Espèces réactives de l’azote et de l’oxygène (RNOS). Relation Structure-Fonction. Enzymologie. Spectroscopies RPE. Résonance Raman. Modélisation moléculaire. Hémoprotéines. Cytochrome P450. NO Synthase (NOS). Flavoprotéines. P-glycoprotéine (P-gp). Amyloïde . Métabolisme. Candidats médicaments. Environnement.

​Les publications de l'équipe