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Laboratoire


Méthodes d'analyses

Ingénierie des protéines

Publié le 6 avril 2017
Une des activités majeures du Service est le développement et l’Ingénierie de protéines pour des applications thérapeutiques, diagnostiques et/ou de valorisation en biotechnologie.

Responsables
Loïc Martin
loic.martin@cea.fr
Hervé Nozach
herve.nozach@cea.fr


Pour l’obtention de quantités suffisantes de protéines, notamment pour leur analyse structurale, notre équipe a mis en place une plateforme de production rapide, à l’échelle du laboratoire, de ces protéines dans deux formats d’expression : expression dans Escherichia coli (E. Coli) et cellules humaines HEK293 en suspension. Pour l’analyse fonctionnelle des protéines d’intérêt, nous avons développé une panoplie de techniques visant à analyser, quantifier et cribler les interactions protéines-protéines. Quant à l’aspect ingénierie des protéines, différentes approches sont également appréhendées : l’une consiste à créer des biosimilaires en transférant des domaines de protéines d’interaction sur des « miniprotéines ». Le fondement de toutes ces technologies est la capacité à générer de la diversité ciblée couplée à une méthodologie de criblage des mutants optimisés.

 
Représentation de la procédure d’expression chez E. Coli et du choix de la protéine de fusion


Cette plateforme d’expression de protéines dans Escherichia coli (E. Coli) et cellules humaines HEK293 en suspension comprend l’instrumentation et l’expertise dans les différentes étapes que sont :

  • le clonage dans différents plasmides d’expression utilisant des protéines de fusion facilitant l’expression, le repliement et la purification des protéines d’intérêt
  • les différentes pièces de culture de niveau L1 à L2.
  • les étapes de clarification et de purification sur des chaines d’Akta Purifiers automatisés et fonctionnant en parallèle

Cette plateforme d’expression répond aux demandes d’expression de protéines des différentes équipes du laboratoire et travaille de concert avec les autres équipes de support que sont les méthodes d’analyses (notamment par spectrométrie de masse) et l’étude de structure par cristallographie aux rayons X.


Différentes techniques sont utilisées pour l’analyse des interactions protéines-protéines :

  • Technologie cell-display, ELISA
  • Technologie double-hybride bactérien et en levure
  • Technologie d’analyse d’interactions par méthode spectrale : Anisotropie de fluorescence, spectrométrie de fluorescence, FRET, BRET, BiFC (Bimolecular fluorescence complementation).
  • Technologie « label-free » : Résonance plasmonique de surface (Biacore 3000), Interférométrie de couches biologiques (Blitz – ForteBio)
  • Cytométrie de flux (FACS)

Quelques appareils pour l’analyse d’interactions protéines-protéines (Résonance plasmonique de surface, cytométrie de flux)

 

 

 

 

Cytomètre de flux de paillasse (Guava easyCyte™ Flow Cytometer, Merck-Millipore)

 

 

 

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