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Soutenance de thèse

Rôle d’une ATPase de type P4 dans l’homéostasie des glycérolipides membranaires chez Arabidopsis thaliana

​Mercredi 07 décembre 2016 à 13:30 Amphithéâtre Chrome 1, Parvis Louis Néel, Grenoble

Publié le 7 décembre 2016
César Botella - Laboratoire Physiologie Cellulaire & Végétale, Institut de Biosciences et Biotechnologies de Grenoble​
Dans les cellules eucaryotes, chaque membrane a une composition lipidique qui lui est propre. La composition des membranes est finement régulée en fonction des conditions environnementales et physiologiques de la plante. Cette homéostasie lipidique est le résultat des processus de synthèse, conversion, dégradation et de trafic des lipides. Si la majorité des enzymes impliqués dans le métabolisme des lipides est identifiée, la majorité des mécanismes de transferts intermembranaires des lipides reste à caractériser. Nous nous concentrons sur l'homéostasie lipidique des chloroplastes et plus particulièrement celle des galactolipides, lipides essentiels des membranes photosynthétiques. Les galactolipides sont synthétisés au niveau de l'enveloppe des chloroplastes. Cependant, une grande partie des galactolipides proviennent de la phosphatidylcholine, elle-même synthétisée dans le réticulum endoplasmique. Cette délocalisation de la voie de synthèse sur deux compartiments souligne l'importance de l’étape de transfert lipidique associé. 
Des études transcriptomiques ont montré qu'ALA10, une ATPase de type P4, flippase de phospholipides, est surexprimée dans des conditions faisant varier la synthèse des galactolipides, telles que l'inhibition chimique des MGDG synthases par la galvestine-1 ou la carence de phosphate. Le but de cette thèse est de caractériser ALA10 et d'analyser son rôle dans ce trafic lipidique et dans l’homéostasie des galactolipides chloroplastiques.
Pour comprendre le rôle d'ALA10, nous avons d'abord étudié sa localisation subcellulaire à l'aide d'une fusion traductionnelle avec la GFP et effectué des analyses lipidiques de différentes lignées exprimant ALA10 à différents niveaux. L’analyse de la composition lipidique indique qu'ALA10 stimule la synthèse des galactolipides et limite la désaturation de la phosphatidylcholine dans le réticulum endoplasmique. Nous avons recherché les partenaires protéiques potentiels d'ALA10 permettant d'expliquer ces effets et utilisé une approche de complémentation de fluorescence bimoléculaire afin d'étudier ces interactions. Nous avons pu déterminer qu'ALA10 interagit avec ALIS1 et ALIS5, deux sous-unités beta potentiellement nécessaires à la localisation et à la fonction d'ALA10, et confirmer leurs colocalisation avec ALA10 à l'aide de fusions GFP/CFP. ALA10 peut être localisée dans le réticulum endoplasmique à proximité des chloroplastes avec ALIS5 ou au niveau de la membrane plasmique avec ALIS1. Nous avons aussi pu déterminer qu'ALA10 interagit avec l’acide gras désaturase, FAD2, et une E3-ubiquitine ligase, PUB11. L''interaction avec FAD2 confirme un lien entre ALA10 et la désaturation de la phosphatidylcholine. 
Nous avons ensuite étudié l'effet d'ALIS1 et d'ALIS5 sur la fonction d'ALA10 en utilisant des lignées n’exprimant pas ces protéines ou les surexprimant avec ALA10. L'observation en microscopie électronique a révélé que la forme des chloroplastes et leurs relations avec le système endomembranaire sont modifiées en fonction de l'ALIS coexprimée avec ALA10. Les analyses lipidiques effectuées sur les plantes mutantes confirment un effet d’ALA10 sur l’homéostasie des galactolipides et la désaturation de la phosphatidylcholine. Les résultats suggèrent plusieurs fonctions d'ALA10, dépendantes de l’ALIS. Cet effet apparait variable en fonction de la photopériode ou du rythme circadien et indiquent une régulation post traductionnelle d'ALA10. Le rôle de PUB11 dans cette régulation a été exploré.
Au final, cette étude révèle que, dans les cellules chlorophylliennes, ALA10, une flippase de phospholipides du réticulum endoplasmique, est impliquée dans la dynamique de désaturation de la phosphatidylcholine. Son activité stimule la synthèse des galactolipides et active la biogenèse des membranes photosynthétiques, probablement, en favorisant les échanges de lipides entre le chloroplaste et le réticulum endoplasmique.