En tant qu’enzymes spécialisées dans la production de ROS, le rôle des NADPH oxydases s’étend à de nombreux processus physiologiques majeurs, et la dérégulation de celles-ci peut conduire à une grande variété de pathologies sévères, telles que le diabète ou les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, constituant ainsi une cible primordiale pour le développement de solutions thérapeutiques spécifiquement adaptées. Malgré la découverte récente d’homologues procaryotes de NOX, facilitant la production de ces protéines en quantités compatibles pour les études mécanistiques, et constituant ainsi des modèles favorisant l’étude fonctionnelle et structurale de la famille des NADPH oxydases, la résolution d’une structure haute résolution sous forme entière est toujours demeurée sans solution. 
Ainsi, à travers l’utilisation d’une approche interdisciplinaire, ce projet a pour but de relever les enjeux majeurs associés à l’obtention de cristaux dont la qualité de diffraction permettrait la résolution de la première structure d’un homologue de NADPH oxydase sous forme entière, complexifiée par la présence de larges zones hydrophobes intrinsèques au rôle de transfert d’électrons à travers les membranes de ces protéines, et pouvant altérer la formation et l’intégrité des contacts cristallins.
Des conditions optimales de détergents et de tampons au sein de laquelle l’enzyme combine une importante activité associée à une haute thermostabilité ont été identifiées par criblage systématique des conditions de sels et pH pour la purification de l’enzyme et ainsi optimiser la préservation de l’intégrité de la protéine afin de favoriser la qualité des cristaux obtenus. De plus, à travers l’implémentation d’étapes conjointes de criblages ainsi que d’affinements automatiques et manuels extensifs, un effort intense a ainsi été initié afin d’optimiser le processus de cristallogenèse et des avancées majeures ont pu être réalisées concernant la cristallisation de SpNox permettant d’améliorer la diffraction des cristaux initiaux de 11Å à 4.3Å.
En parallèle, une caractérisation basse résolution, réalisée par diffusion des neutrons aux petits angles, a permis de déterminer une enveloppe globale de la protéine. Le volume de cette enveloppe, plus large que le modèle d’homologie de la protéine sous forme entière reconstituée par l’ancrage des deux domaines modélisés indépendamment, suggère l’existence d’une flexibilité importante de SpNox dans la région charnière entre les domaines TM et DH, fournissant ainsi des informations essentielles et apportant une explication aux difficultés rencontrées pour abaisser la limite de résolution des cristaux.
Afin de s‘affranchir de cette flexibilité, une stratégie complémentaire, impliquant la caractérisation structurale de chacun des domaines dissociés de SpNox a été initiée en caractérisant indépendamment avec succès les domaines TM et DH de SpNox. Des développements considérables ont été réalisés grâce à l’obtention de cristaux du domaine déshydrogénase, dont la qualité a permis la collecte de données selon des limites de diffraction atteignant 1.8Å permettant ainsi d’accéder à des informations à une résolution atomique, autorisant la visualisation de détails structuraux au sein de ce domaine, qui, en association avec le modèle d’homologie du TM obtenu par une approche bioinformatique, peut servir à guider certaines études fonctionnelles.
Enfin, le traitement des données de diffractions de manière à interpréter l’anisotropie au sein de cristaux de SpNox entière, et ainsi extraire le maximum d’informations contenant les détails structuraux, la résolution atteinte a pu être améliorée à 3.2Å selon le meilleur axe de diffraction, et pourrait ainsi permettre ainsi de résoudre la première structure basse résolution de NOX entière. Bien que la qualité de la densité électronique obtenue ne permette pas la visualisation de l’ensemble des détails nécessaires à la compréhension de la mécanistique enzymatique et au design spécifique d’inhibiteurs, l’obtention de cette structure, présentant probablement un état ouvert de la protéine compatible avec la flexibilité démontrée par les études SANS, constitue une avancée importante vers l’obtention d’une structure haute résolution. En effet, l’observation de distances approximatives entre les résidus pourra permettre une approche de biologie moléculaire à travers des processus de mutagenèses informé par les données structurales, afin notamment d’introduire des mutations stabilisantes, ou permettant de ponter les deux domaines et ainsi de réduire la flexibilité de l’enzyme constatée lors de l’étude SANS.
Cette stratégie pourrait résulter en une amélioration significative de la résolution de 3.2Å des cristaux de SpNox sous forme entière afin de s’approcher encore du but ultime de ce projet complexe.