La maladie de Huntington (HD) est une maladie neurodégénérative mortelle causée par une expansion anormale des répétitions CAG dans le gène HTT, ce qui entraîne une extension polyglutamine dans la protéine huntingtine. Bien que le gène mutant soit hérité à la naissance, les symptômes moteurs apparaissent généralement au milieu de la vie. Les premières caractéristiques de la HD comprennent un dérèglement de la transcription et des perturbations métaboliques. Les modifications post-traductionnelles des histones (hPTMs) jouent un rôle essentiel dans la régulation des gènes et constituent un lien entre le métabolisme et l'épigénétique. Notamment, l'acétylation de la lysine 27 de l'histone H3 (H3K27ac) est diminuée au niveau des corps de gènes d'identité neuronale, ce qui corrèle avec leur baisse d’expression. Ce projet a utilisé la spectrométrie de masse pour explorer le rôle des hPTMs au-delà de l'acétylation dans l'HD, en incluant de nouvelles acylations comme la lactylation et la crotonylation.
J'ai établi un protocole complet pour la préparation des échantillons d'histones et l'analyse des données protéomiques correspondantes. Le pipeline bioinformatique a été compilé dans un package R, histonePTM hébergé sur GitHub, permettant une analyse automatisée et reproductible des hPTMs.
Alors que seul le variant H3.3 existe chez l'homme, les souris possèderaient d'autres variants H3 spécifiques. Deux variants, H3mm7 et H3mm13, possèdent des transcrits abondants dans le cerveau. Ces variants diffèrent de H3.3 par un seul acide aminé dans la partie H3K27-R40. Une approche rigoureuse de validation a été développée pour analyser 40 combinaisons séquences x PTMs. Les séquences de H3 et H3.3 ont été identifiées et quantifiées, mais H3mm7 a été à peine détecté et H3mm13 n’a pas été détecté par protéomique ciblée. Ces variants H3mm ont alors été exclus des analyses suivantes.
Les hPTMs des histones H3 et H4 ont été analysées dans les striatas des souris WT et R6/1 modèle de HD. Aucune différence significative dans l'abondance des hPTMs n'a été observée. De façon intéressante, plusieurs lysines ont été identifiées sous forme lactylées, mais leur quantification s’avère très difficile. Compte tenu de l'hétérogénéité cellulaire du striatum, le tri des noyaux par FANS a été tenté pour isoler les noyaux des neurones de ceux des cellules gliales, pour en extraire les histones. Bien que la première tentative ait échoué en raison des quantités limitées d'échantillons, des recommandations d'amélioration méthodologique ont été formulées pour les études futures. L'un des principaux défis de la protéomique des histones est la co-élution des peptides isomères de position, ce qui complique l'identification et la quantification. Bien que la dérivatisation standard des lysines non modifiées avec l'anhydride propionique augmente l'hydrophobie des peptides, elle est insuffisante pour séparer certains peptides isobares, en particulier ceux de l'extrémité N-terminale de l'histone H4. L'anhydride triméthylacétique (TMA), un agent de dérivatisation récemment décrit, s'est révélé prometteur pour améliorer la séparation de ces peptides. Dans ce projet, nous avons optimisé le protocole de dérivatisation du TMA et caractérisé son impact sur l'identification et la quantification des hPTMs. Enfin, nous avons démontré son utilité dans les expériences de traçage par isotopes stables, qui consiste à suivre la cinétique d'incorporation d'acétyle marqué dans les histones après injection de 13C-glucose à des souris.
Dans le cadre de mon doctorat, j'ai établi un protocole robuste de dérivatisation des histones pour leur analyse protéomique et un outil bioinformatique pour l'analyse des hPTMs. Je les ai mis en œuvre pour étudier les hPTMs dans le contexte de la HD. Il reste à mettre en place la quantification fiable des lactylations, et les analyses des hPTMs dans les neurones versus les cellules gliales, afin de mieux élucider les altérations épigénétiques dans la maladie.​

​​​Contact : Delphine Flieger