La régulation de l’expression des gènes est assurée par la dynamique des modifications post-traductionnelles des histones. Pendant ces 15 dernières années, un vaste panel de nouvelles structures a été découvert, collectivement appelées acylations. Ces structures permettent de réguler finement la transcription par l’état métabolique de la cellule. Toutefois, leurs rôles dans la régulation de l'expression génique restent peu caractérisés. Mon projet de thèse s’est centré sur cette problématique, dans le contexte de la spermatogenèse murine.
Dans la première partie de ce projet, j’ai exploré par spectrométrie de masse et par immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse les marques crotonyl, butyryl et bêta-hydroxybutyryl pour essayer de valider leur présence dans les histones extraites du testicule de souris. Les expériences autour de ces marques, principalement sur la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27), ainsi que sur d’autres résidus, n’ont pas abouti à leur identification. En complément, j’ai contribué à une étude sur l’existence de variants souris-spécifiques. En particulier, j’ai interprété des données middle-down qui ont permis de valider avec confiance la présence de l’histone canonique H3.1 et des variants H3.3 et Testis-Specific H3 dans les testicules de souris, mais pas la présence des variants spécifiques de la souris H3mm7 et H3mm13.
La deuxième partie de ce projet réside dans l’identification et la caractérisation de la lactylation, récemment découverte. Ce travail constitue l’aspect novateur et le plus abouti de mon projet de thèse. En effet, j’ai établi une cartographie de la lactylation et de l'acétylation sur de nombreuses lysines des histones H3 et H4, par analyse protéomique exploratoire (DDA). La quantification quasi impossible de la lactylation par DDA en raison d'événements d'oxydation nous a incitées à développer une méthode d’analyse protéomique ciblée, en utilisant des peptides synthétiques marqués par des isotopes stables et modifiés avec les énantiomères L-lactyl et D-lactyl. Les résultats ont montré que les peptides portant du L-lactyl ou du D-lactyl étaient d’abondances similaires sur la plupart des lysines de H3 et H4. La stœchiométrie de la lactylation a finalement été estimée : cette modification est très peu abondante et stable (0.01-0.5%) sur toutes les lysines étudiées.
Enfin, une dernière partie a porté sur la caractérisation d’un anticorps dirigé contre la marque H3K18(L-lactyl). Par Résonance Plasmonique de Surface (SPR) et par immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, j’ai montré que cet anticorps n’est pas parfaitement spécifique de sa cible. Il présente aussi une forte affinité pour la marque lactyl sur la lysine H3K23. De plus, il reconnait les modifications structurellement proches de lactyl telles que l’hydroxy-iso-butyrylation, et dans une moindre mesure l’acétylation, qui est d’abondance relative importante sur ce résidu. Les résultats de spectrométrie de masse ont montré un net enrichissement des marques lactylées sur H3K18 ou H3K23, mais dans une certaine mesure aussi de marque acétylée sur H3K18 et de la forme di-acétylée sur H3K18/K23, que cela soit sur H3.1 et sur le variant TSH3. De manière intéressante, cet anticorps montre une reconnaissance similaire des deux énantiomères L-lactyl et D-lactyl.
Mes travaux de thèse illustrent la complexité de l’étude des nouvelles acylations sur les histones. Mon projet sur la lactylation a mis en lumière la présence des deux énantiomères L-lactyl et D-lactyl sur un grand nombre de lysines des histones H3 et H4, à l’échelle du testicule de souris. L’identification et la quantification fiables de peptides d’histones L- et D-lactylés résultent d’un travail pointilleux. L’étude de la lactylation est en pleine expansion depuis sa découverte en 2019, mais la caractérisation des deux marques L-lactyl et D-lactyl simultanément est très peu explorée. Mon travail s’inscrit ainsi dans une démarche originale et novatrice.

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