Ce travail de thèse consiste en une étude structurale approfondie d’une famille de protéines fluorescentes infrarouges (IFP) développées à partir du bactérophytochrome d’une bactérie Gram-négative du genre Bradyrhizobium, constituée de la protéine mIFP et de ses variants décalés vers le bleu iBlueberry et iBlueberry2. Les IFP présentent un fort intérêt en imagerie de corps entier en raison de l’existence d’une fenêtre optique des tissus entre 650 et 900 nm, au-dessus du domaine de longueur d’onde dans lequel l’hémoglobine et la déoxi-hémoglobine absorbent, et en-dessous du domaine dans lequel l’eau et les lipides absorbent et diffusent la lumière. Les protéines étudiées ici présentent un pic d’émission de fluorescence entre 660 et 720 nm.
Le bactériophytochrome et les IFP qui en sont dérivées utilisent la biliverdine, un produit du catabolisme des hèmes, comme chromophore afin d’absorber la lumière entre 640 et 690 nm. L’étude structurale a permis de montrer qu’une boucle localisée au voisinage de la biliverdine pouvait aborder un grand nombre de conformations, à la différence des autres phytochromes et IFP étudiés jusqu’à présent, où cette boucle ne semble posséder qu’une seule conformation. La conséquence de cette fluctuation conformationnelle est la présence d’une configuration du chromophore jamais encore observée menant à une conformation compacte du macrocycle formé par les quatre cycles pyrroles de la biliverdine, distincte de la conformation linéaire, ou étendue, habituellement observée. Les spectroscopies d’absorption UV-Visible et d’émissions de fluorescence in crystallo, c’est-à-dire directement appliquées aux cristaux, ont permis de montrer que la conformation compacte du chromophore menait à un pic d’émission de fluorescence au-delà de 760 nm pour iBlueberry et iBlueberry 2, et de 800 nm pour mIFP. Cette conformation semble être favorisé par l’empilement cristallin, et être seulement très faiblement peuplée en solution.
L’analyse des séquences de bactériophytochromes et d’IFP a permis de mettre en évidence la conformation particulière du coude beta au début de la boucle en question. L’ingénierie de ce coude beta chez un membre d’une autre famille de protéines fluorescentes a montré qu’elle permettait effectivement d’augmenter la plasticité de la boucle.

​ Ce travail donne des pistes pour modifier la configuration du chromophore au sein de la protéine par ingénierie rationnelle, notamment en utilisant des méthodes basées sur l’intelligence artificielle, et ainsi permettre d’obtenir de nouvelles IFPs avec des maxima d’émission en plein milieu de la fenêtre optique des tissus, afin de mieux utiliser celle-ci dans des expériences de marquage à plusieurs couleurs en imagerie tissulaire ou de corps entier.
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